如何解決倒置熒光顯微鏡使用常見問題？

倒置熒光顯微鏡是細胞培養、細胞轉染和很多生物研究中常用的儀器，相比共聚焦顯微鏡，倒置熒光顯微鏡的成像精度雖然稍低，但儀器更普及，更容易買到或者約到，而且使用維護都更簡單點。今天我們就給大家分享下倒置熒光顯微鏡使用可能遇到的常見問題，以及可能的解決辦法。

·什么是倒置熒光顯微鏡

倒置熒光顯微鏡MF52-CF

倒置熒光顯微鏡由倒置顯微鏡和落射熒光模塊組成，倒置顯微鏡是相對正置顯微鏡的概念，其物鏡、照明系統相對樣品的位置是顛倒的；落射熒光模塊是熒光觀察的核心部件，有轉盤式熒光模塊和集成熒光模塊兩種，轉盤式后期可升級，但需要獨立的熒光光源燈箱，用轉盤式模塊的倒置熒光顯微鏡更大、更重、更貴。

·為什么要用倒置熒光顯微鏡

倒置熒光顯微鏡通常最高只會配40X物鏡，因此放大倍率、分辨率不如正置熒光顯微鏡，但勝在應用層面更方便好用。

倒置熒光顯微鏡觀察多孔板

首先倒置熒光顯微鏡的物鏡有更長工具距離，可以適配各種培養皿從底部直接成像，從而節省了反復制樣做玻片的麻煩，效率更高更適合大批量、多視野培養細胞等樣品的觀察。

倒置熒光顯微鏡觀察無沾染觀察

另一點優勢是倒置熒光顯微鏡可以無沾染觀察，無沾染意思是因為觀察無需打開培養皿，可避免取樣制樣帶來的沾染污染風險。

倒置熒光顯微MF53-N搭配顯微操作系統

最后一個倒置熒光顯微鏡的優勢是更大的工作空間，因為倒置熒光顯微的明場照明系統采用的是長工作距離聚光鏡，因此載物臺上方有更大空間，更方便安裝使用顯微操作系統等配件。

·怎么使用倒置熒光顯微鏡

倒置熒光顯微鏡相襯和熒光疊加成像

倒置熒光顯微鏡通常可以實現明場、相襯和熒光觀察，如果儀器附近有貼SOP或者說明書，可以看看，快速上手。明場觀察很簡單，可以看病理切片等樣品，這里不贅述；相襯觀察需要切換到相襯物鏡，然后把上光源光強調高，聚光鏡光闌調到PHP位置（最大位置），切換相襯環板到對應的位置即可；難點是熒光觀察，不同倒置熒光顯微鏡有不同結構，大致可以分為研究級倒置熒光顯微鏡和新型倒置熒光顯微鏡兩種，我們分別以MF53-N和MF52-N為例進行說明。

研究級倒置熒光顯微鏡MF53-N

MF53-N是研究級倒置熒光顯微鏡的代表，它采用轉盤式熒光模塊，可以按需選擇不同的熒光激發塊，背面帶熒光燈箱接口，可以使用大功率寬光譜LED熒光光源MG-100、四通道光源MG-120或者汞燈等作為熒光光源。

這種倒置熒光顯微鏡會有獨立的光源控制器，首先關閉明場光源，通過控制器打開熒光光源，調節光強，然后轉盤選擇熒光通道，放樣品，操作對焦，再切換分光拉桿到相機成像拍照。不同熒光通道需要分別調節光強并拍照，如果是MG-100或者MG-120，光源可以即開即用，亮度可自由調節，比較方便，而汞燈使用需要預熱、亮度只能靠ND減光鏡控制，操作更復雜，也更容易出各種問題。

倒置熒光顯微鏡MF52-N

MF52-N是新型倒置熒光顯微鏡的代表，它采用高度集成的數顯LED熒光模塊，不需要外接熒光燈箱和控制器，能直接在模塊上控制熒光開關、光強設置和通道切換等操作，并提供數據化光強顯示，可以配備3個熒光通道，滿足BGU等常見的熒光觀察需要，更易于使用。

新型倒置熒光顯微鏡結構比研究級簡單，首先關閉明場光源，打開模塊上的光源開關，然后拉桿切換熒光通道并調節光強，放樣品，后續操作和研究級一樣就行。奧林巴斯CKX41、CKX53都可以通過明美的倒置熒光模塊升級成類似的新型倒置熒光顯微鏡。

升級熒光觀察的DMIL

另外，尼康TS100、徠卡DMIL這兩款無限遠光學倒置，也能通過我們的熒光模塊和熒光光源升級成倒置熒光顯微鏡，但它們都是外掛熒光光源搭配推拉切換熒光通道的設計，用起來比一般的新型倒置熒光顯微鏡復雜些。

·怎么拍出好的熒光圖片？

高靈敏度相機成像更好

這是很多實驗操作人員非常關心的問題，首先要說明的一點是，倒置熒光顯微鏡的光路結構比正置熒光顯微鏡復雜，光損更大，因此熒光拍照難度比正置高，需要比較高靈敏度的相機，比如MSX11、MC50-S等，尤其一些采用了固定分光設計的倒置熒光顯微鏡。

半復消色差物鏡效果更好

第二個點是選擇合適的物鏡，落射熒光觀察中激發光和發射光都需要經過物鏡一趟，物鏡熒光通過率低的話會導致光損非常大，一般的相襯物鏡、帶厚度適配環的物鏡都有較大光損，可以的話應該選擇半復消色差的相襯物鏡/普通物鏡，它們上面會有SAPO（Semi-APO）、PL FL、Fluor之類標記，如果有APO標記的復消色差的物鏡更好，如果沒有半復消色差用Plan標記的平場消色差的物鏡也還能湊合。

多色熒光需要分別微調對焦

第三個點是對焦，不同熒光通道的波長不同，焦面會有一定的偏移，因此不同熒光通道需要分別微調對焦才能獲得更銳利的成像，明美顯微數碼測量分析系統軟件界面下方的清晰度狀態數據可以為對焦提供參考。如果您是半復消色差的相襯物鏡，還能先在相襯下對好焦，再切換到熒光拍照，減少淬滅的可能性。

·可能遇到哪些常見問題？

倒置熒光顯微鏡結構比共聚焦簡單，出問題的機率更低，但并不是不會出問題，好消息是很多問題可能簡單處理一下也能排除。

熒光模塊沒轉到位會擋住激發光

常見問題1：完全沒有激發光。從光源開始檢查光路，光源接好并打開了嗎？熒光切換機構是否旋轉到位/拉桿切換到位了？是否有錯位的ND濾鏡？是否Shutter關上了？如果整個光路都正常，可能就是光源壞了，對于汞燈就是換燈泡，LED熒光光源可能換個通道還能用，因為不同熒光通道對應的是不同的LED燈珠/燈珠陣列。

分光拉桿沒拉到位會沒有成像

常見問題2：有激發光但沒成像。先觀察分光欄桿，分光欄桿沒到位的話目鏡和相機都會沒有成像，目鏡通常很好確認有無熒光，除非是CY5之類肉眼看不見的近紅外波長。目鏡有成像，相機看不到就要調整曝光時間和曝光增益，如果近期升級過系統可能還有驅動失效之類問題。如果最終成像細節較差、容易過曝，基本就是相機靈敏度太低的問題，除了升級相機沒有什么好方法解決。

亂動燈箱上的旋鈕會導致熒光不均勻

常見問題3：有成像但有異常瑕疵，就要看情況。比如熒光不均勻，可能是熒光燈箱調錯了聚光位置；有強熒光背景，可能是上聚光鏡反光了，上聚光鏡有擋板的用擋板，無擋板的收小光闌也可能有用；FITC和TRITC完全重疊、有信號但預期目標沒染出來，可能不是儀器問題，是出現了交叉反應，需要重新檢查染色流程是不是做錯了。

·倒置熒光顯微鏡能不能用高倍油浸物鏡？

一般來說倒置熒光顯微鏡配備的物鏡最高只有40X，因為倒置熒光顯微鏡的上聚光鏡NA數值孔徑不到0.6，無法匹配60X/100X等高數值孔徑物鏡。但如果只看熒光觀察的話，其實倒置熒光顯微鏡是可以搭配100X油浸物鏡使用的，需要注意的是，100X物鏡是為0.17厚度的蓋玻片校正的，因此需要使用0.17厚度的共聚焦培養皿或者反轉放置的細胞爬片。

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